重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响,从而为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。方法全骨髓法培养兔BMSCs,按感染复数(MOI)值不同设定为四组,分别转染兔BMSCs,观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值,进行后续实验。转染兔BMSCs,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV对细胞增殖活性的影响。以重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(AAV-EGFP)为参照,行流式细胞仪检测,计算转染效率。AAV-hBMP4与对照病毒AAV-EGFP分别转染细胞,观察细胞形态,行碱性磷酸酶(ALP)染色、Von Kossa染色及ALP含量测定,观察成骨活性。兔肌袋实验观察异位成骨情况。结果MOI值为5×10~4 vg/cell时,AAV对细胞形态影响最小,以此值进行后续实验。AAV转染后,细胞增殖活性良好,转染效率为55％～65％。AAV-hBMP4转染后,细胞形态呈现典型的成骨改变,ALP染色及Von Kossa染色均出现成骨的特征性改变,而AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定显示,实验组ALP含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=218．65,P＜0．01)。兔肌袋实验术后4周组织学检测可见大量钙盐沉积,矿化结节形成。结论AAV-hBMP4转染效率高,对BMSCs的增殖活性影响小,AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨的理想种子细胞。     

组织工程化表皮膜片构建及其在供皮区的应用研究

目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于供皮区创面治疗。方法利用患者少量自体或同种异体正常皮肤分离、培养、扩增的表皮细胞,接种于壳聚糖明胶膜构建成表皮细胞膜片;将膜片移植于治疗组供皮区创面、适度加压,同时设立对照组:空白材料对照以及传统油纱布对照覆盖创面。于术后5～10d、30d、90d行大体观察、组织学检查、广谱角蛋白、外皮蛋白、层粘连蛋白、免疫组织化学检测以及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值测定(偏光显微镜、RTPCR)。结果利用自体及异体表皮细胞和壳聚糖明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床供皮区创面治疗15例,经过3个月随访,疗效肯定。移植膜片创面愈合时间(8.1±1.3)d,空白材料对照区为(16.2±3.8)d,空白油纱布对照区为(23.0±5.8)d。移植膜片存活良好,结构较完整、术后30d及90d观察:12例无明显增生,3例有轻度增生(20.0%),而空白油纱布对照区11例遗留增生性瘢痕(74.4%,χ2=8.127,P<0.01)。结论表皮细胞-壳聚糖明胶膜片能促进供皮区创面早期愈合并减少后期瘢痕增生,具有良好治疗效果。     

Membrane-seeded autologous chondrocytes: cell viability and characterization at surgery

The implantation of chondrocytes, seeded on matrices such as hyaluronic acid or collagen membranes, is a method that is being widely used for the treatment of chondral defects. The aim of the present study was to evaluate the distribution, viability and phenotype expression of the cells seeded on a collagen membrane just at the time of the implantation. Twelve patients who were suffering from articular cartilage lesions were treated by the MACI^® procedure. The residual part of each membrane was tested by colorimetric assay (MTT) and histochemical and ultrastructural analyses were carried out. In all of the samples a large number of viable cells, quite homogenously distributed, was detected. The cells expressed the markers of the differentiated hyaline chondrocytes. These data reassure in that the MACI procedure provides a suitable engineered tissue for cartilage repair, in line with the clinical evidences emerging in the literature.     

A Decision Rule for Predicting Bacterial Meningitis in Children with Cerebrospinal Fluid Pleocytosis When Gram Stain Is Negative or Unavailable

Objectives:  Among children with cerebrospinal fluid (CSF) pleocytosis, the task of separating aseptic from bacterial meningitis is hampered when the CSF Gram stain result is unavailable, delayed, or negative. In this study, the authors derive and validate a clinical decision rule for use in this setting.
Methods:  This was a review of peripheral blood and CSF test results from 78 children (<19 years) presenting to Children's Hospital Columbus from 1998 to 2002. For those with a CSF leukocyte count of >7/μL, a rule was created for separating bacterial from viral meningitis that was based on routine laboratory tests, but excluded Gram stain. The rule was validated in 158 subjects seen at the same site (Columbus, 2002–2004) and in 871 subjects selected from a separate site (Boston, 1993–1999).
Results:  One point each (maximum, 6 points) was assigned for leukocytes >597/μL, neutrophils >74%, glucose <38 mg/dL, and protein >97 mg/dL in CSF and for leukocytes >17,000/mL and bands to neutrophils >11% in peripheral blood. Areas under receiver-operator-characteristic curves (AROCs) for the resultant score were 0.98 for the derivation set and 0.90 and 0.97, respectively, for validation sets from Columbus and Boston. Sensitivity and specificity pairs for the Boston data set were 100 and 44%, respectively, at a score of 0 and 97 and 81% at a score of 1. Likelihood ratios (LRs) increased from 0 at a score of 0 to 40 at a score of ≥4.
Conclusions:  Among children with CSF pleocytosis, a prediction score based on common tests of CSF and peripheral blood and intended for children with unavailable, negative, or delayed CSF Gram stain results has value for diagnosing bacterial meningitis.     

支架及无支架条件下构建组织工程软骨的研究进展

支架材料的研究是组织工程的研究热点之一,软骨细胞复合培养给组织工程软骨的构建带来希望,单一的材料诸如胶原、透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白凝胶等已经证明可以与软骨细胞复合培养,两种或者多种材料复合可以提高材料的性能,更好地用于组织工程软骨的构建,并满足软骨缺损修复的需要;同样,在无支架情况下应用软骨细胞聚集培养、沉淀培养的方法,可以构建组织工程软骨,并给软骨缺损的修复带来新希望,但目前的研究较少。两者是组织工程软骨构建的两个主要方向。     

联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响

目的:观察体外联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响,为研究成纤维细胞和平滑肌细胞生物学特性和相互关系以及体外构建含此两种细胞的组织工程皮肤提供理论和实践基础。方法:在体外分别分离培养成纤维细胞和平滑肌细胞并常规传代培养。模拟组织工程皮肤的结构及成纤维细胞和平滑肌细胞间的相互影响途径,按照不同比例(平滑肌细胞:成纤维细胞=1:1,1:2,1:3)建立以胶原凝胶为基质的成纤维细胞与平滑肌细胞联合培养模型。应用荧光标记、组织学观察和MTT法对平滑肌细胞的形态和代谢进行研究。结果:联合培养模型法可以有效地建立起成纤维细胞和平滑肌细胞的相互影响模式。1:1组的成纤维细胞对联合培养的平滑肌细胞增殖有促进作用,1:3组的促增殖作用则不明显。结论:1:1联合培养的成纤维细胞对平滑肌细胞增殖有促进作用,对它们体外培养和扩增以及相互关系的研究对阐明这两种细胞组合作为真皮替代物种子细胞具有重要的意义。     

兔股骨干缺损模型的制备及在组织工程骨实验中的应用

目的为组织工程骨修复负重骨缺损的研究提供标准化的实验动物模型.方法测量兔股骨干基本解剖数据,用于指导制备模型.在解剖学研究的基础上,取4～5个月龄成年新西兰大白兔18只,随机分为三组,每组6只,分别制备10、15、20mm的股骨干中段骨和骨膜缺损,并用普通钢板螺丝钉固定股骨.4、8、12周时分别摄X线侧位片进行定性分析,双能量X线骨密度测量仪（DXA）做骨密度扫描进行定量分析,并在每个时间点分别取2只动物取材做大体观察和组织学检查.结果兔股骨解剖数据：兔股骨长94.1 mm;股骨干中点横径7.4 mm,矢状径5.8 mm;骨皮质厚度：屈侧最厚,内、外两侧次之,伸侧最薄,平均1.2 mm;髓腔略呈椭圆形,其横径与矢状径相差约1mm,取其平均值,髓腔直径4.1 mm.骨缺损动物大体观察、X线片、骨密度检查和组织学检查显示：10 mm骨缺损组均于8～12周出现骨性愈合;15 mm和20 mm骨缺损组直至12周仍未见骨愈合.结论在不桥接和填充任何材料的情况下,钢板螺钉固定的兔股骨干15 mm以上的实验性骨缺损不能自行愈合,可用于组织工程骨修复负重骨缺损的实验研究.     

使用抗体-生物纳米磁珠复合体的免疫凝集检测法

使用从磁性细菌体内提取的生物纳米磁珠，在磁珠表面联上特定的抗体，以玻片免疫凝集检测法检测癌胚抗原（carcinoembryonic AntigenCEA）。结果表明使用5μg的CEA抗体-磁珠复合体，可以检测出100pg／ml浓度的CEA，在操作性、经济性上优于免疫荧光检测法。     

种子细胞双相接种技术促进组织工程骨体外成熟的研究

目的 比较观察双相接种法和静置接种法构建组织工程骨对种子细胞增殖、分化和成骨表达的影响。方法 取健康志愿者骨髓，密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化，然后应用双相接种法和静置接种法与脱钙骨基质（DBM）复合构建组织工程骨，体外培养3周，用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞密度、形态及基质分泌情况，并在不同时相点测定组织块中DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量变化。结果 倒置显微镜下双相接种法构建的组织块可见大量具有一定折光性的梭形细胞存在于胶原基质中。扫描电镜见双相接种法构建的组织块切面较平坦，孔隙较小，细胞包埋在胶原中，而静置接种法构建的组织块可见细胞、细胞外基质较少。在体外培养过程中，双相接种法组织块中细胞的DNA含量、ALP活性均高于静置接种法，钙含量在培养2周后高于静置接种法。结论 双相接种法是一种高效的组织工程骨构建方法，有利于提高接种效率和促进组织工程骨的体外成熟。